主角哈特利，原名服部贯蔵，是日本伊贺流的少年忍者，服部半藏的后代。他大约10岁，以微微上翘的嘴角和脸颊上的螺旋酒窝为特征。在东京三叶家中修行，性格沉着冷静，忠诚而有忍术天赋，但对青蛙有深深的恐惧。他常穿着蓝色忍者服，洗澡时会把衣服折叠后扎在头上，头巾从不离身，连弟弟新藏也未曾见过他没有头巾的样子。他的口头禅是“忍忍忍”。

三叶健一是第二男主角，习惯被称作“健一”，戴着眼镜，学习和运动能力一般，但他擅长摄影。他收留了哈特利兄弟，成为他们的好友，常向哈特利请教忍术。

新藏，即“服部心藏”，5岁，是见习中的忍者，面颊上有红红的圆形标记，身穿红色忍者服。他活泼好动，不像哥哥那样稳重，喜欢与健一和狮子狗玩耍。他的必杀技是“涙Power”。

狮子丸是伊贺流的忍者犬，会说人话，贪吃，是哈特利的忠诚伙伴。它身形肥胖，喜欢吃竹轮，武器是骨头手里剑，会利用皮肉拉伸技巧施展忍术。与甲贺忍者猫影千代是对手，口头禅是“ニョニョ(Nyo Nyo)”。

烟卷是哈特利的劲敌，甲贺流忍者，虽然有时与哈特利合作，但大部分时间敌对。他隐藏忍者身份，扮成普通孩子，常捉弄健一，与猫影千代同住。他穿青绿色忍者服，小辫子是他的标志。

在新的原作中，影千代是烟卷的忍者猫，黑色的外表，会说话，常与狮子丸斗嘴。她的忍术略优于狮子丸，得意技是电气猫。

小池老师是健一他们的老师，常在藤子作品中出现。三叶健太郎是健一的父亲，一位普通的上班族，视哈特利如己出。健一的母亲是家庭主妇，同样疼爱哈特利。河合梦子是品学兼优的少女，是健一和烟卷的追求对象。

动画原创角色小燕子是8岁的女忍者，对哈特利心生仰慕，常去健一家拜访。而忍者怪兽吉波则是哈特利幼时的玩伴，拥有多种忍术，性格温和，喜欢吃大福麻糬。

博士是发明家，曾与哈特利等人敌对，后成为朋友，还发明了机械忍者机械丸。刺次郎是博士培养的仙人掌，拥有超能力，会因不喜欢的人而攻击。

服部阵藏是哈特利父亲，伊贺忍者学校的老师，为故事增添了更多的忍者背景。

伊贺流三大上忍都是谁啊?他们都有什么贡献啊

在伊贺，有一座行基开设的叫“伊贺四十九院”的寺院。这里以供奉着弥勒菩萨的本堂为中心，周围围着四十九间山伏房。这里从建立开始，就教授给一般平民各种武术（忍术）。到了平安时代末期，藤原千方、熊坂长范、伊势三郎义盛，和被称为"烟幕之末"的异能集团也加入了他们，势力更盛。而伊贺流忍术的始祖——服部平左卫门家长也登上了历史舞台。

据说服部家长在坛之浦合戦中战死了。但也有种说法是他活了下来，并逃回了伊贺，把姓改成了“千贺地”。不管这中说法是真是假，这个千贺地氏在数代后出了个叫半三保长的，他带着一族人移居到了京，入仕将军家足利义晴，并在那里恢复了服部的姓氏。 本来在伊贺，最有势力的是服部氏、百地氏和藤林氏，被合称为伊贺上忍三家。因为服部氏的离开，百地氏掌握了实权。但是不久之后就发生了与织田家的大激战“天正伊贺之乱”，国灭。